PROTOCOLO DE DIGESTIÓN EN GEL

Precauciones:
• Utilizar guantes en todo momento para evitar la contaminación con queratina.
• De preferencia preparar las soluciones en material de vidrio y en el mismo día de su uso.
• No utilizar tubos Eppendorf de colores.

Recomendaciones:
• Lavar los tubos Eppendorf previo a su uso con metanol o etanol puro y luego secar a temperatura ambiente.
• Preparar el gel el día anterior a la corrida, para eliminar acrilamida que puede reaccionar con las proteínas.
• No almacenar las bandas de gel por tiempos prolongados ya que las proteínas se oxidan y degradan. Almacenar liofilizada, en pequeño volumen e agua o solución de fijación/destinción a -20ºC.
• Evitar en la preparación de la muestra: sales (suprimen la señal, interfieren con la ionización y forman aductos), detergentes (inhiben la ionización) y solventes orgánicos no volátiles (retardan la cristalización de la matriz).

Protocolo de digestión:

1. Cortar la banda/spot de proteína de interés del gel utilizando una hoja de bisturí, eliminando al máximo el exceso de poliacrilamida. Transferir la banda/spot a un tubo Eppendorf de 0,5 mL.

2. Lavar la banda/spot recortado con 500 μL de agua durante 15 min a temperatura ambiente, repetir 3 veces. Agitar suavemente.

3. Desteñir la banda recortada con 150 μL de bicarbonato de amonio 200 mM preparado en acetonitrilo 50% v/v durante 30 min a 30ºC. Agitar brevemente antes de incubar.

4. Descartar el sobrenadante y repetir el paso 2 al menos dos veces (hasta que la banda de gel pierda su coloración azul).
La banda se verá blanca opaca, sino preparar solución fresca de destinción, y repetir paso 2.
Centrifugar y remover el exceso de solución de destinción.

5. Agregar 50 μL de ditiotreitol 10 mM preparado en bicarbonato de amonio 200 mM y agitar brevemente antes de incubar a 37ºC durante 20 min. Remover el sobrenadante, centrifugar para remover el exceso de de solución.

6. Agregar 50 μL de yodoacetamida 55 mM preparado en bicarbonato de amonio 200 mM, agitar brevemente e incubar a 37ºC durante 20 min (en oscuridad). Remover el exceso de yodoacetamida. Agregar 100 μL de acetonitrilo 100% e incubar durante 5 min a 37ºC. Remover el sobrenadante.

7. Agregar 50 μL de acetonitrilo 100% e incubar a 37ºC durante 5 min. Remover el exceso de solución. Repetir el proceso, centrifugar para remover el exceso de solución.
La banda se verá blanca opaca y disminuirá de tamaño.

8. Secar a temperatura ambiente durante 10 min, y luego colocar en hielo.

9. Agregar 8 μL de tampón de digestión bicarbonato de amonio 50 mM / acetonitrilo 10% v/v que contiene 0,3 μg/μL de tripsina (ver preparación de tripsina) e incubar en hielo durante 45 min. Sumergir completamente la banda en el tampón de digestión.

10. Agregar 20-40 μL de bicarbonato de amonio 50 mM / acetonitrilo 10% v/v de modo de cubrir la banda recortada, e incubar durante toda la noche (8-16 h) a 37ºC. Minimizar el volumen agregado.

11. Recuperar el sobrenadante y transferir a un nuevo tubo Eppendorf de 0,5 mL.

12. Agregar 20 μL de acetonitrilo 60% v/v / ácido fórmico 0,1% v/v sobre la banda, aplicar vórtex durante 1-2 min y centrifugar, incubar durante 10 min a 30ºC.

13. Recuperar el sobrenadante y combinar con sobrenadante de paso 10.

14. Repetir pasos 11 y 12.

15. Agregar 20 μL de acetonitrilo 100% v/v e incubar durante 20 min, recuperar el sobrenadante y combinar con sobrenadante de paso 13.

16. Secar los sobrenadantes combinados en SpeedVac a temperatura ambiente (no exceder 30ºC) durante 2-4 h.

17. Resuspender en 12 μL de ácido fórmico 0,1% v/v, sonicar durante 5 min.

Preparación de tripsina:

1. Reconstituir el liofilizado (20 μg) en 200 μL ácido clorhídrico 1 mM de modo de obtener una concentración de tripsina de 0,1 μg/μL. Alicuotar en volúmenes de 10 μL y almacenar a -20ºC.

2. Diluir con bicarbonato de amonio 50 mM / acetonitrilo 10% v/v de forma que 1 μg de tripsina (10 μL) se aplique a tres bandas/spots (considerar 8 μL de tampón de digestión por banda/spot).