PROTOCOLO DE DIGESTIÓN EN SOLUCIÓN

Precauciones:
• Utilizar guantes en todo momento para evitar la contaminación con queratina.
• De preferencia preparar las soluciones en material de vidrio y en el mismo día de su uso.
• No utilizar tubos Eppendorf de colores.

Recomendaciones:
• Lavar los tubos Eppendorf previo a su uso con metanol o etanol puro y luego secar a temperatura ambiente.
• Preparar el gel el día anterior a la corrida, para eliminar acrilamida que puede reaccionar con las proteínas.
• Evitar en la preparación de la muestra: sales (suprimen la señal, interfieren con la ionización y forman aductos), detergentes (inhiben la ionización) y solventes orgánicos no volátiles (retardan la cristalización de la matriz).

Protocolo de digestión:

1. Para muestras liofilizadas o previamente precipitadas resuspender en 100 μL de guanidina/HCl 6 M (alternativamente en urea 6-8 M o SDS 0,1% p/v), ditiotreitol 2-5 mM (o β-mercaptoetanol) en tampón bicarbonato de amonio 50 mM.
Para muestras líquidas mezclar en proporción 1:4 con bicarbonato de amonio 62,5 mM que contiene SDS 0,125% p/v y ditiotreitol 5 mM, preparar 100 μL de la mezcla.

2. Incubar a 95ºC durante 15-20 min o 60ºC durante 45-60 min, o si la muestra se preparó en urea incubar a temperatura ambiente durante 45-60 min. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente.

3. Agregar 20 μL de yodoacetamida 200 mM preparado en tampón bicarbonato de amonio 50 mM, mezclar suavemente e incubar durante 1 h a temperatura ambiente y en oscuridad.

4. Agregar 20 μL de ditiotreitol 200 mM preparado en tampón bicarbonato de amonio 50 mM para detener la reacción y consumir el exceso de yodoacetamida. Mezclar suavemente e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.

5. Diluir las muestras con tampón bicarbonato de amonio 50 mM de modo que la concentración de urea o guanidina/HCl sea menor a 1 M. Para las muestras preparadas en SDS la dilución no es necesaria.

6. Agregar tripsina a una razón final de tripsina:proteína entre 1:100 y 1:20 p/p. Incubar a 37ºC durante 1 h.

7. Terminar la reacción cambiando el pH a 3-4 con ácido fórmico o congelando a -20ºC.

8. Determinar el grado de digestión de una alícuota de la muestra en SDS-PAGE.

9. En caso de requerir mayor tiempo de digestión se puede reajustar el pH sobre 4 o incubar nuevamente a 37ºC.

10. Concentrar la muestra en SpeedVac a temperatura ambiente durante 2-4 h (no exceder 30ºC).

11. Resuspender en 12 μL de ácido fórmico 0,1% v/v.

Preparación de tripsina:

1. Reconstituir el liofilizado en ácido acético 50 mM o tampón de resuspensión de modo de obtener una concentración de tripsina de 0,1 μg/μL (almacenar a -20ºC hasta un mes o alternativamente almacenar a -80ºC).