PROTOCOLO DE TINCIÓN CON AZUL DE COOMASSIE COLOIDAL (G250)

Precauciones:
• Utilizar guantes en todo momento para evitar la contaminación con queratina.

Recomendaciones:
• Lavar recipiente de tinción previo a su uso con metanol o etanol puro y luego secar a temperatura ambiente.
• Preparar el gel el día anterior a la corrida, para eliminar acrilamida que puede reaccionar con las proteínas.
• Evitar en la preparación de la muestra: sales (suprimen la señal, interfieren con la ionización y forman aductos), detergentes (inhiben la ionización) y solventes orgánicos no volátiles (retardan la cristalización de la matriz).

Protocolo de tinción:

1. Al finalizar la electroforesis fijar el gel en solución de fijación etanol:ácido fosfórico:agua = 50:3:47 v/v/v (para 50 mL mezclar 25 mL de etanol + 1,5 mL de ácido fosfórico + 23,5 mL de agua) durante toda la noche.

2. Remover el exceso de solución de fijación lavando el gel 3 veces durante 30 min/vez con agua.

3. Equilibrar el gel en solución de Neuhoff que contiene sulfato de amonio:metanol:ácido fosfórico:agua 16:25:5:54 p/v/v/v (para 50 mL mezclar 8 g de sulfato de amonio + 12,5 mL de metanol + 2,5 mL de ácido fosfórico + 27 mL de agua) durante 1 h.

4. Agregar azul de coomassie G250 a la solución de Neuhoff de modo de obtener una concentración de 1 g/L (agregar 0,05 g a 50 mL)

5. Incubar el gel en la solución de Neuhoff / azul de coomassie G250 durante toda la noche (para la visualización de proteínas en baja concentración).

6. Lavar el gel con agua y recortar bandas de interés o almacenar el gel en ácido acético 5% v/v a 4ºC.